北京抗體藥物熱原檢測(cè)法規(guī)要求

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2025-10-29

生物制品（如單克隆抗體、重組蛋白、細(xì)胞因子）因基質(zhì)成分復(fù)雜（含高濃度蛋白質(zhì)、螯合劑、表面活性劑、緩沖鹽等），在熱原檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)“反應(yīng)抑制”或“非特異性增強(qiáng)”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。選擇抗干擾能力更強(qiáng)的檢測(cè)方法至關(guān)重要，重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）因采用完整級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑，抗干擾性?xún)?yōu)于天然 LAL；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）對(duì)復(fù)雜基質(zhì)耐受性更高，通過(guò)適當(dāng)稀釋即可消除多數(shù)干擾，因此生物制品熱原檢測(cè)常采用 “rCR 法（內(nèi)毒素定量）+ MAT 法（全熱原篩查）” 的聯(lián)合方案，既保證內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又防控非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險(xiǎn)。

選擇熱原檢測(cè)單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定法，即是選擇更準(zhǔn)確、更安全、更可持續(xù)的檢測(cè)方案。北京抗體藥物熱原檢測(cè)法規(guī)要求

一次合格的 MAT 法熱原檢測(cè)，需同時(shí)滿(mǎn)足 “合格標(biāo)曲” 與 “合格樣品檢測(cè)值及回收率” 兩大關(guān)鍵條件。合格標(biāo)曲需具備四要素：一是良好線性，采用 4-Parameter Logistic 擬合，R2 需接近 1.0，避免線性不佳導(dǎo)致定量偏差；二是良好信號(hào)值，各濃度點(diǎn) OD 值需呈梯度變化，高濃度點(diǎn) OD 值需足夠（如上限濃度 OD600 達(dá) 1.0 左右），信號(hào)過(guò)低會(huì)影響靈敏度；三是良好 CV，復(fù)孔間 CV 需控制在合理范圍（定量限內(nèi)≤25%、定量上下限≤30%），確保重復(fù)性；四是良好背景值，陰性對(duì)照 OD 值需低于標(biāo)曲下限濃度點(diǎn) 10%，排除外源污染。合格樣品檢測(cè)值則需滿(mǎn)足加標(biāo)回收率在 50%-200%，例如文檔中某樣品 10 倍稀釋回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范圍內(nèi)調(diào)整稀釋倍數(shù)，同時(shí)樣品熱原濃度需低于規(guī)定限值（CLC），方可判定樣品符合要求。

血液制品熱原檢測(cè)體系熱原檢測(cè)MAT零動(dòng)物消耗，降低檢測(cè)成本，提升檢測(cè)效率和倫理水平。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)家兔體溫應(yīng)答篩查所有類(lèi)型熱原，尤其適用于無(wú)法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無(wú)法滿(mǎn)足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。

單核細(xì)胞系憑借標(biāo)準(zhǔn)化、可控性等優(yōu)勢(shì)，有效解決PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）在熱原檢測(cè)中的局限。其一，單核細(xì)胞系源自永生化細(xì)胞株（如 Mono-Mac-6），經(jīng)篩選后細(xì)胞特性高度均一，消除供體差異，讓熱原檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性大幅提升。其二，其培養(yǎng)過(guò)程可控，培養(yǎng)基配方與環(huán)境（溫度、CO?濃度）可準(zhǔn)確調(diào)控，能維持細(xì)胞好的活性，避免 PBMC 因分選、凍存導(dǎo)致的活性衰減。其三，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境波動(dòng)耐受性更強(qiáng)，可保障細(xì)胞遺傳穩(wěn)定且無(wú)污染物風(fēng)險(xiǎn)，降低熱原檢測(cè)的操作復(fù)雜度與誤差率。

無(wú)論是注射劑、生物制品，還是醫(yī)療器械的接觸材料，都能在我們的熱原檢測(cè)下，得到準(zhǔn)確的“安全認(rèn)證”。

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過(guò)嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過(guò)程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無(wú)明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說(shuō)明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

熱原具有頑強(qiáng)穩(wěn)定性、耐熱性（180℃/2h才能破壞）、水溶性、濾過(guò)性，可穿透常規(guī)滅菌屏障。血液制品熱原檢測(cè)體系

通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，熱原檢測(cè)MAT法驗(yàn)證了對(duì)LTA、酵母多糖等非內(nèi)毒素?zé)嵩臋z出能力。北京抗體藥物熱原檢測(cè)法規(guī)要求

湖州申科生物MAT試劑盒配套的即用型細(xì)胞，需嚴(yán)格遵循解凍與使用規(guī)范，避免細(xì)胞活性下降影響熱原檢測(cè)結(jié)果。首先，解凍操作需快速：從液氮罐或 - 80℃冰箱取出細(xì)胞后，立即放入 37℃水浴鍋快速解凍（約 1-2 分鐘），避免緩慢解凍導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，損傷細(xì)胞膜；解凍后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，細(xì)胞解凍后需一次性使用完畢，不建議按量添加培養(yǎng)基或添加劑后分次使用—即用型細(xì)胞經(jīng)工藝優(yōu)化，活性與濃度已預(yù)調(diào)，分次使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不均（如部分細(xì)胞活化、部分休眠），影響熱原反應(yīng)性。使用時(shí)需嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作：將解凍后的細(xì)胞直接加入含樣品的微孔板中，無(wú)需額外洗滌或稀釋?zhuān)魳悠窞楦邼舛然|(zhì)，可提前用無(wú)熱原培養(yǎng)基稀釋樣品（不超 MVD），但細(xì)胞不可稀釋。此外，解凍后的細(xì)胞需在 30 分鐘內(nèi)完成加樣，避免室溫放置過(guò)久導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，若無(wú)法及時(shí)加樣，需置于 37℃培養(yǎng)箱暫存，但不超過(guò) 1 小時(shí)，確保細(xì)胞用于熱原檢測(cè)時(shí)處于較好的活性狀態(tài)。

北京抗體藥物熱原檢測(cè)法規(guī)要求

標(biāo)簽：宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè) 內(nèi)毒素檢測(cè) 熱原檢測(cè) 宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè) 支原體檢測(cè)

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