傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。PCR 反應(yīng)中通過控制溫度變化使得核酸分子重復(fù)地解鏈與延伸，從而實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)擴(kuò)增。珠三角相對定量qPCR儀廠家

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，范圍廣用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。湛江靈敏度qPCR儀廠家q225pcr無需參比染料、無需定期校準(zhǔn)，更加簡化的操作流程與減輕的維護(hù)負(fù)擔(dān)只為更好地專注于實驗。

而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時期對模板起始量進(jìn)行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長期內(nèi)，熒光信號到達(dá)熒光檢測閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴(kuò)增曲線的Ct值都與初始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴(kuò)增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實現(xiàn)定量分析。

qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針法為主的熒光探針法（Cycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號，PCR過程中，當(dāng)擴(kuò)增生成dsDNA時，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被千倍放大，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。終點(diǎn)法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。

PCR反應(yīng)需要五種關(guān)鍵試劑：PCR模板：也稱為模板DNA，需要常規(guī)的試劑盒進(jìn)行提取。如基因組DNA（gDNA），cDNA和質(zhì)粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反應(yīng)都需要可在高溫下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一種常用的酶，它可以在70°C時以60個堿基/秒的速率整合核苷酸，并可以擴(kuò)增高達(dá)5kb的模板，使其適用于無特殊要求的標(biāo)準(zhǔn)PCR。引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它們需要在哪里開始擴(kuò)增。在PCR中，這些序列稱為引物，是單鏈DNA的短片段（約15-30個堿基）。脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新鏈的基礎(chǔ)，包括四個基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。PCR緩沖液：PCR緩沖液可確保在整個PCR反應(yīng)過程中保持比較好條件。PCR緩沖液的主要成分包括氯化鎂（MGCl2，充當(dāng)DNA聚合酶的輔助因子），tris-HCl和氯化鉀（在反應(yīng)過程中保持穩(wěn)定的pH值）。目前市面上已經(jīng)有很多成熟的包含PCR緩沖液的Taq聚合酶。使用 PCR 擴(kuò)增 DNA 是當(dāng)今實驗室的一項基礎(chǔ)技術(shù)，創(chuàng)新不斷將其應(yīng)用范圍從研究實驗室擴(kuò)展到臨床。廣州準(zhǔn)確qPCR儀報價

dPCR比qPCR準(zhǔn)確度與精密度高。珠三角相對定量qPCR儀廠家

qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，它可以特異結(jié)合目的產(chǎn)物的DNA序列。其檢測原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），即熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在目標(biāo)DNA分子擴(kuò)增過程中因為聚合酶的外切活性從而水解分離使熒光信號的釋放；隨著擴(kuò)增過程的推進(jìn)，機(jī)器實時檢測增強(qiáng)的熒光信號，從而產(chǎn)生終的熒光擴(kuò)增曲線。根據(jù)修飾基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標(biāo)和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現(xiàn)今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應(yīng)中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對TaqMan探針進(jìn)行切割，使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號不會被淬滅，釋放的熒光信號被機(jī)器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結(jié)合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價格偏高。珠三角相對定量qPCR儀廠家

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